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Poly(A)聚合酶是从重组菌株E.coli中分离得到，可以催化ATP以AMP的形式依次掺入到RNA的3'末端，即在RNA的3'末端加多聚A尾。Poly(A)聚合酶具有很高的加尾效率，可以在RNA的3'末端加入20~200个A碱基。聚腺苷酸化提高了RNA在细胞中的稳定性，增强了转染或显微注射后RNA的表达效率。Poly(A)尾在某些应用中可作为第一链cDNA合成的引物结合位点，并可用于末端标记或定量miRNA。

• 用于RNA 3'末端标记；
  
• 为RNA添加Poly(A)尾，用于克隆或亲和纯化。比如将miRNA添加Poly(A)，为cDNA合成提供oligo-dT引物结合位点；
  
• 提高RNA在真核细胞中的翻译效率。

• 该酶只能以RNA为底物。
  
• 该酶将AMP添加到RNA的3'末端具有较高的选择性，并不会在所有RNA分子中添加相同长度的Poly(A)。
  
• 该酶需要Mg²⁺等二价阳离子才具有活性。
  
• RNA加A尾长度受酶量、ATP和反应时间等因素影响，不同的实验需要加A的量会有所不同，可通过控制反应时间及酶量来调整加A的长度，该酶在37℃反应30分钟时可加约30个A碱基，1小时可加约100个A碱基。
  
  • 相同RNA量及反应时间随酶量增加，加尾长度增大，如下图：
    
    
  • 相同RNA量，加入5U的酶量，随时间延长，加尾长度逐渐增大，如下图：
    
  
  
• 该酶使用M-MuLV逆转录酶反应缓冲液，也可以进行反应。
  
• EDTA抑制该酶活性。若停止反应，可通过添加EDTA至终浓度10mM，或直接对反应体系进行纯化。
  
• 加尾结束后，在转染细胞或显微注射前，必须对RNA进行纯化，具体纯化方式见操作流程。

• 加尾流程
  
  • 按下表加入各成分配制反应体系(20μL)：
    

    成分	用量
    10×Poly(A) Polymerase Buffer	2μL
    ATP (10mM)	1μL
    RNA	1～10μg
    Poly(A) Polymerase(5U/μL)	0.2～1μL
    RNase-Free Water	至20μL

    
    
  • 充分混匀，37℃反应30～60min。
• RNA纯化
  
  • 酚/氯仿纯化法
    酚/氯仿抽提可去除蛋白和大部分游离核苷酸。
    
    • 加入160μL RNase-free Water将产物稀释至180μL。
      
    • 加入20μL 3M的醋酸钠(pH5.2)到稀释后的产物中，用移液器充分混匀。
      
    • 加入200μL的酚/氯仿混合液(1：1)进行抽提，室温10000rpm离心5min，将上层溶液(水相)转移至新的RNase-free EP管中。
      
    • 加入与水相等体积的氯仿抽提2次，收集上层水相。
      
    • 加入2倍体积的无水乙醇并混匀，-20℃孵育至少30min，4℃ 15000rpm离心15min。
      
    • 弃上清并加入500μL预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃ 15000rpm离心，弃上清。
      
    • 开盖干燥2min，加入20～50μL RNase-free Water或其他缓冲液溶解RNA沉淀。
      
    • -80℃保存。
  • 柱纯化
    柱纯化可以去除蛋白和游离核苷酸。
    纯化前加入80μL RNase-free Water将产物稀释至100μL，再按柱纯化说明书进行纯化。
    注：由于RNA产量较高，为避免超出结合柱的承载能力，请对所需柱子数量进行预估。
    
  • 磁珠纯化
    磁珠纯化可以去除蛋白和游离核苷酸。
    按磁珠纯化说明书进行纯化。
    
  • 氯化锂纯化
    
    • 20μL体积分别加入30μL的氯化锂沉淀液（7.5M氯化锂，50mM EDTA）和30μL RNase-Free Water（氯化锂的终浓度需保持在2.5-2.8M）；
      
    • 混匀后放入-20℃放置至少30min。
      
    • 12000rpm离心15min，去上清，收集沉淀。
      
    • 用预冷的70%的乙醇洗三次。
      
    • RNase-Free Water复溶后检测。
• RNA定量
  
  • 紫外吸收法：游离核苷酸会影响定量的准确性，采用此方法前请先进行RNA纯化。
    
  • 染料法：用RiboGreen染料进行RNA定量，游离核苷酸不会影响定量，可以对纯化或者未纯化的反应产物中的RNA进行准确定量。

• Poly(A)尾比预期的长。
  
  • 适当缩短反应时长；
    
  • 适当减少反应体系中酶的加量；
    
  • 通过引入更多的RNA来提高反应体系中RNA的浓度，或减小整个反应体系的体积。
• Poly(A)尾比预期的短。
  
  • 适当延长反应时间；
    
  • 适当增加反应体系中酶的加量；
    
  • 通过减少RNA的量来降低反应体系中RNA的浓度，或增大整个反应体系的体积。
• 加尾失败
  
  • RNA 3’末端可能隐藏在二级结构中，可通过适当加热以解除二级结构影响；
    
  • RNA底物被污染，可再次进行RNA底物纯化；
    
  • 酶失活，确认酶是否保存于-20℃，实验操作时保持酶始终置于冰上；
    
  • ATP降解，确认ATP保存于-20℃，验操作时保持酶始终置于冰上。